激光共聚焦顯微鏡是如何工作的？

　　激光共聚焦顯微鏡的工作原理如下：

　　

　　1、激光光源：

　　

　　使用一束強(qiáng)度穩(wěn)定、單色、相干性好的激光光源，常用的激光光源包括氬離子激光器、氦氖激光器和二極管激光器等。激光光源通過(guò)準(zhǔn)直器和聚焦鏡系統(tǒng)聚焦成一束準(zhǔn)直的、直徑極小的激光光斑。

　　

　　2、共聚焦技術(shù)：

　　

　　采用共聚焦技術(shù)，即通過(guò)聚焦光斑和探測(cè)光斑的重疊來(lái)實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。聚焦光斑從樣品的一個(gè)點(diǎn)與探測(cè)光斑重疊之后，僅有從這個(gè)點(diǎn)散射回來(lái)的光能夠通過(guò)探測(cè)光斑，其他來(lái)自樣品其他區(qū)域的光則被阻隔掉。這樣可以消除樣品其他區(qū)域的散射光對(duì)圖像質(zhì)量的影響。

　　

　　3、掃描成像：

　　

　　激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過(guò)探測(cè)針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線(xiàn)接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。在這個(gè)光路中，只有在焦平面的光才能穿過(guò)探測(cè)針孔，焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線(xiàn)在探測(cè)小孔平面是離焦的，不能通過(guò)小孔，因此非觀(guān)察點(diǎn)的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔與探測(cè)針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，即共聚焦。以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描，在此過(guò)程中兩次聚焦，故稱(chēng)為激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　

　　4、三維成像：

　　

　　通過(guò)自動(dòng)移動(dòng)焦點(diǎn)位置獲取多個(gè)共焦圖像，根據(jù)非連續(xù)的焦點(diǎn)位置（Z）和檢測(cè)光強(qiáng)度（I），系統(tǒng)可以估算每個(gè)像素的光強(qiáng)變化曲線(xiàn)（I-Z曲線(xiàn)），并獲得其峰值位置和峰值強(qiáng)度。由于所有像素的峰值位置與樣品表面的不規(guī)則性相對(duì)應(yīng)，因此可以獲得樣品表面的3D形貌信息。

　　

　　總之，激光共聚焦顯微鏡利用激光光源、共聚焦技術(shù)以及掃描成像等原理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高分辨率、高對(duì)比度、非破壞性的三維成像和表面拓?fù)浞治?，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。