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    激光共聚焦顯微鏡是如何工作的?

    更新時(shí)間:2024-11-17      點(diǎn)擊次數(shù):170
      激光共聚焦顯微鏡的工作原理如下:
      
      1、激光光源:
      
      使用一束強(qiáng)度穩(wěn)定、單色、相干性好的激光光源,常用的激光光源包括氬離子激光器、氦氖激光器和二極管激光器等。激光光源通過(guò)準(zhǔn)直器和聚焦鏡系統(tǒng)聚焦成一束準(zhǔn)直的、直徑極小的激光光斑。
      
      2、共聚焦技術(shù):
      
      采用共聚焦技術(shù),即通過(guò)聚焦光斑和探測(cè)光斑的重疊來(lái)實(shí)現(xiàn)高分辨率成像。聚焦光斑從樣品的一個(gè)點(diǎn)與探測(cè)光斑重疊之后,僅有從這個(gè)點(diǎn)散射回來(lái)的光能夠通過(guò)探測(cè)光斑,其他來(lái)自樣品其他區(qū)域的光則被阻隔掉。這樣可以消除樣品其他區(qū)域的散射光對(duì)圖像質(zhì)量的影響。
      

    激光共聚焦顯微鏡

     

      3、掃描成像:
      
      激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì),受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡,通過(guò)探測(cè)針孔時(shí)先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管(PMT)或冷電耦器件(cCCD)逐點(diǎn)或逐線(xiàn)接收,迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。在這個(gè)光路中,只有在焦平面的光才能穿過(guò)探測(cè)針孔,焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線(xiàn)在探測(cè)小孔平面是離焦的,不能通過(guò)小孔,因此非觀(guān)察點(diǎn)的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔與探測(cè)針孔,焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像,即共聚焦。以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描,在此過(guò)程中兩次聚焦,故稱(chēng)為激光掃描共聚焦顯微鏡。
      
      4、三維成像:
      
      通過(guò)自動(dòng)移動(dòng)焦點(diǎn)位置獲取多個(gè)共焦圖像,根據(jù)非連續(xù)的焦點(diǎn)位置(Z)和檢測(cè)光強(qiáng)度(I),系統(tǒng)可以估算每個(gè)像素的光強(qiáng)變化曲線(xiàn)(I-Z曲線(xiàn)),并獲得其峰值位置和峰值強(qiáng)度。由于所有像素的峰值位置與樣品表面的不規(guī)則性相對(duì)應(yīng),因此可以獲得樣品表面的3D形貌信息。
      
      總之,激光共聚焦顯微鏡利用激光光源、共聚焦技術(shù)以及掃描成像等原理,實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高分辨率、高對(duì)比度、非破壞性的三維成像和表面拓?fù)浞治?,在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
      
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