熒光共聚焦顯微鏡的成像原理是怎樣的？

　　熒光共聚焦顯微鏡系統主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數字信號處理器、計算機和圖像輸出設備。那么你知道它的成像原理是怎樣的嗎？

　　

　　熒光共聚焦顯微鏡用一個點光源來照射標本，在焦平面上形成一個小的、定義明確的光斑。該光斑照射后發出的熒光由物鏡收集，并沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光器。分光器將熒光直接送到檢測器。在光源和檢測器前面都有一個針孔，分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同，約為100-200納米；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，也就是說，光點可以通過一系列透鏡同時聚焦于照明針孔和檢測針孔。這樣，來自焦平面的光可以集中在檢測孔的范圍內，而來自焦平面上方或下方的散射光則被阻擋在檢測孔之外，無法成像。激光對樣品進行逐點掃描，檢測針孔后的光電倍增管也逐點獲得相應光點的共焦圖像，轉換為數字信號傳輸給計算機，最后在屏幕上匯集成整個焦平面的清晰共焦圖像。
 

　　

　　每個焦平面圖像實際上是標本的一個光學截面，它總是有一定的厚度，也被稱為光學切片。由于焦點處的光強度遠遠大于非焦點處的光強度，而非焦點面的光被針孔過濾，所以共焦系統的景深近似為零。沿著Z軸方向掃描可以實現光學斷層掃描，在待觀察樣品的焦點處形成一個二維的光學切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過積累連續層的二維圖像，用專門的計算機軟件進行處理，就可以得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點上，使聚焦面以外的激發熒光不能進入檢測針孔。

　　

　　熒光共聚焦顯微鏡的工作原理可以簡單表述為：以激光為光源，在傳統熒光顯微鏡成像的基礎上增加激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制進行數字圖像采集和處理的系統。