淺析熱反射式激光共聚焦顯微鏡的成像原理

　　熱反射式激光共聚焦顯微鏡是一種利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、目前先進的分子細胞生物學的分析儀器。主要用于觀察活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等。
 

　　下面小編給大家講講熱反射式激光共聚焦顯微鏡的成像原理：
 

　　熱反射式激光共聚焦顯微鏡采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm;相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。
 

　　每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫切面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結(jié)合，通過累加連續(xù)層次的二維圖像，經(jīng)過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。
 

　　即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進入檢測針孔。
 

　　激光共聚焦的工作原理簡單表達就是它采用激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控制來進行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。